首先解释一下pcr实验室里的这个实时定量pcr实验是什么？实时定量pcr技术也叫qpcr，是指在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个pcr进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。

但是想要得到满意的检测结果并不简单，做过这个实验的都知道，其中任何一个步骤操作失误，都会导致它的检测结果出现异常！ pcr实验室里，实时定量pcr的这些常见问题你弄清是怎么回事了吗？

1、无Ct值出现

pcr实验室里，做实时定量pcr检测时出现无Ct值的情况，一般是因为这几个原因：

检测荧光信号的步骤有误：一般染料法采用72℃延伸时采集，探针法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性。

模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

反应循环数不够：一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号。

2、阴性对照出现明显扩增

pcr实验室里，做实时定量pcr检测时发生阴性对照出现明显扩增的情况，一般是因为这几个原因：

反应体系组分（如水）被污染：实验过程中，更换新的Mix或者水重复实验。

标本间的交叉污染或产物污染：反应体系在超净工作台内配制，对实验室进行严格的区分，减少气溶胶污染；使用带滤芯的枪头。

引物二聚体的出现：引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

引物浓度不佳：这时候可以适当下调下引物的浓度。

3、熔解曲线出现多峰

引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现。

引物浓度不佳：这时候可以适当下调下引物的浓度。

退火温度低：高了就降低。

4、扩增效率低

pcr实验室里，做实时定量pcr检测时发生扩增效率低的情况，一般是因为这几个原因：

反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

反应条件不佳：这时候就可以适当的调整降低退火的温度，或者改为三步扩增法。

反应体系中有抑制物：一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到体系中，减少抑制物的影响。

5、实验重复性差

pcr实验室里，做实时定量pcr检测时发生实验重复性差的情况，一般是因为这几个原因：

加样体积失准：使用性能较好的移液枪，扩大反应体积，将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中。

定量pcr仪不同位置温度控制不一致：定期校准仪器。

模板浓度太低：模板浓度不能太低了，不然重复性肯定差，这时候要调整模板稀释度或提高加样体积。

qpcr mix没有完全混匀：使用前充分混匀。

文章出自 科研实验外包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/